酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（Tartrate-Resistant Acid Phosphatase：TRAP）は、破骨細胞の分化マーカーとして広く認識されており、破骨細胞の培養においては、分化に伴い培地中に放出されます¹⁾²⁾。
本製品は、培養破骨細胞のTRAP活性を検出する試薬セットで、破骨細胞の分化や骨粗鬆症薬の評価にご使用いただけます。
培養上清または固定した細胞に、p-ニトロフェニルリン酸を含むTRAP基質溶液を加え、TRAP酵素の反応により生じたp-ニトロフェノールを405 nmの吸光度により検出する簡便な方法です。

セットの構成

1. TRAP Assay Substrate Solution（製品コード：TRAP-S1、15 mL、2本）
2. TRAP Assay Stop Solution（製品コード：TRAP-E1、15 mL、2本）

プロトコール概略

培養上清のTRAP活性

1. マウスマクロファージ細胞株 RAW264.7を、10%FBS含有 MEMαにて培養プレートに播種し、同時にRANKLおよび評価薬剤を添加して培養する。
    96well：2,000cells / 0.2 mL / well
    48well：5,000cells / 0.5 mL / well
    24well：10,000cells / 1 mL / well
2. 培養72時間後あるいは96時間後に、吸光度測定用の96wellプレートに培養上清を50 μLずつ回収する。
3. 各wellの上清にTRAP Assay Substrate Solutionを50 μLずつ添加、混合した後、37℃で30分間 ～ 1時間反応（遮光）する。
4. 各wellにTRAP Assay Substrate Solutionを50 μLずつ添加して（この時点で発色します）、撹拌する。
5. 405 nmの吸光度を測定する。

細胞のTRAP活性

1. 培養プレートの各wellの培地を除去した後、10%中性緩衝ホルマリン溶液を添加して、室温で10分間固定する。
2. 固定液を除き、精製水（0.2 ～ 1 mL）にて各wellの細胞を2回洗浄する。
3. 下記容量のTRAP Assay Substrate Solutionを添加、37℃で30分間 ～ 1時間反応（遮光）する。
    96well プレート：100 μL/well
    48well プレート：250 μL/well
    24well プレート：500 μL/well
4. TRAP Assay Substrate Solutionと同量のTRAP Assay Stop Solutionを添加して（この時点で発色します）、軽く撹拌する。
5. 反応液を吸光度測定用の96wellプレートに100 μLずつ回収後、405 nmの吸光度を測定する。

注意事項

1. フェノールレッドを含む培養上清にもご使用いただけます。
2. TRAP基質との反応の際は遮光し、ご使用の培養系に合わせて反応時間を調節してください。反応停止液を添加した段階で発色します。
3. リン酸カルシウム固層化プレート（骨吸収活性評価プレート）を用い、細胞のTRAP活性を測定する場合、Stop Solution添加により白濁しますので、2,000 x g、3分間遠心した後の上清を使用してください。

参考データ

引用文献

1) Alatalo SL, Clin Chem, 2000, 46(11):1751-1754.
2) Lv Y, Exp Ther Med, 2015, 9(1):143-146.

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