コラーゲン抗体惹起関節炎（Collagen Antibody-Induced Arthritis; CAIA）の特徴

コラーゲン惹起関節炎（CIA）はII型コラーゲンに対する自己抗体により惹起されるので、マウスをコラーゲンで免疫する代わりに抗II型コラーゲンモノクローナル抗体のカクテルの単独投与、もしくはリポ多糖（LPS）との組み合わせによって類似の関節炎を発症させることができます。このコラーゲン抗体関節炎（CAIA）は、1998年にChondrexがII型コラーゲンのCB11フラグメント上のエピトープを認識する4種類のモノクローナル抗体で構成されるArthrogen-CIA^®関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテルの販売を開始して以来、広く用いられています。

Lipopolysaccharide（LPS）、Staphylococcal enterotoxin B（SEB）及びMycoplasma arthritidis mitogen(MAM)などのバクテリア毒素はII型コラーゲンに対する自己抗体と相乗効果を示し、重度の関節炎を惹起します。従って、低用量の抗体でマウスに高率に重度の関節炎を発症させることができるため、モノクローナル抗体カクテルとLPSと組み合わせで関節炎を惹起する方法が治療法の評価などの目的に広く用いられています。

コラーゲン抗体関節炎

CAIAの特徴と利点

1. 24-48時間以内に重度の関節炎が惹起されます（図1A）。CIAの場合はII型コラーゲンを免疫後、関節炎惹起までに4週間必要です（図1B）。
2. CAIAはCIAとは異なり特定のMHCハプロタイプを必要とせず、トランスジェニックマウス、ノックアウトマウス、T細胞欠損マウスおよびCIA抵抗性マウスなどを含む多くの系統のマウスに関節炎を惹起することができます。
3. 関節炎の重症度はモノクローナル抗体カクテルの投与量に相関しますので、投与量を増加するとより一貫性のある重度の関節炎を惹起できます。
4. このモデルは動物の免疫系に影響を与える完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを用いないので、抗炎症剤の評価やスクリーニングのみならず、環境因子、炎症細胞、サイトカインや遺伝子産物などの個々の病理学的役割を研究するために適しています。

図1： LPS併用CAIAとCIAの関節炎スコア推移

（A）CAIA：II型コラーゲンに対する4種類のモノクローナル抗体カクテル（2 mg）を0日目にマウスに静脈投与し、さらに3日目にLPS（50 μg）を腹腔内投与しました。関節炎は4日目より惹起され、7-8日目にピークに達しました。試験薬（デキサメタゾン）の治療効果は7日目に明確に観察されました。一方、骨芽細胞の形成や骨破壊は21日目まで進行します。
（B）CIA：関節炎は免疫後4週間後に発症し、炎症は7-8週間後にピークに達します。試験薬の治療効果の評価には5-8週間かかります。

CAIA法とCAI法の比較

関節炎モデルマウスを作製する2つの方法の特徴です。CAIA法はCIA法と比べて発症率が高いため、評価するマウスの数を減らすことが可能です。また、抗体カクテルは高価な印象がありますが、実験期間も短いことから飼育に必要な諸費用や場所を抑えることが出来るため、全体の実験費用としては安くなるケースが多いです。

5クローンモノクローナル抗体カクテル

LPS併用の有無に関わらず、 様々なマウスの系統で効果的に関節炎を惹起するため、Chondrexでは従来の4クローンカクテルに1クローンを加え、5クローン関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテルを開発しました。5クローンカクテル中の3クローンはCB11（CII 124-402）中のLyC1（CII 124-290）のエピトープを認識しており、2クローンはLyC2（CII 291-374）に反応します。

関節炎惹起エピトープはII型コラーゲン分子上に均一に分布していませんが、 マウスのMHCタイプに応じて II型コラーゲンのある特定の領域のエピトープを認識します（DBA/1（H-2q）マウスではCB11、B10.RIII（H-2r）マウスではCB8）。関節リウマチ患者でも同様で、自己抗体は限定されたCBフラグメントと反応します。例えばある患者のグループの自己抗体はCB11に反応し、他のグループの自己抗体はCB8とCB10に反応します。いずれの場合でも患者の自己抗体はコラーゲン分子上に散在する全てのエピトープを認識することはありません。

DBA/1マウスにおける4クローンおよび5クローンカクテルの比較

モノクローナル抗体カクテルをDay 0にDBA/1マウスに投与し、Day 3に50 μgのLPSをIP投与しました。1.5 mgの5クローンカクテル（IP投与）は2 mgの4クローンカクテル（IV投与）と比較し、さらに安定した重度の関節炎をDBA/1マウスに惹起しました。5クローンカクテル1.5 mgは4クローンカクテル2 mgに置き換えることができ、また投与経路もIVからIPとすることができます。

Balb/cマウスにおける4クローンおよび5クローンカクテルの比較

モノクローナル抗体カクテルをDay 0に Balb/cマウスに投与し、Day 3に50 μgのLPSをIP投与しました。1.5 mgの5クローンカクテル（IP投与）は2 mgの4クローンカクテル（IV投与）と比較し、さらに安定した重度の関節炎をBalb/cマウスに惹起しました。Balb/cマウスはモノクローナルカクテルには感受性ですが、4クローンカクテルでは比較的関節炎スコアがばらつく傾向にありました。5クローンカクテルでは安定した重度の関節炎を惹起します。

C-B17/lcrマウスにおける4クローンおよび5クローンカクテルの比較

モノクローナル抗体カクテルをDay 0にC-B17/lcrマウスに投与し、Day 3に50 μgのLPSをIP投与しました。T細胞欠損C.B-17/lcrマウスはCAIAに非常に感受性であり、4クローンカクテル2 mgのIP投与で 重度の関節炎を発症します。5クローンカクテル（2 mg）は4クローンカクテルに比較して安定的に 重度の関節炎を惹起します。

C57BL/6マウスにおける4クローンおよび5クローンカクテルの比較

モノクローナル抗体カクテルをDay 0にC57BL/6マウスに投与し、Day 3に50 μgのLPSをIP投与しました。C57BL/6マウスはCAIAに低感受性であることから、関節炎を惹起するためには、高用量の4クローンモノクローナル抗体カクテル（8-10 mg）が必要です。その重症度は中程度の関節炎であり、マウス間でも大きなばらつきがありました。しかし5クローンカクテルは5 mgのIP投与で10 mgの4クローンカクテル（IP投与）と比較し、同等以上の関節炎を安定的に惹起しました。

関連情報

関節炎惹起抗体カクテルのIP投与およびIV投与の比較

Balb/c、DBA/1、C57BL/6の3種の7-8週齢雄マウスを用いて、IP投与とIV投与の差を調査しました。CAIAに対する感受性はマウスの系統により異なる為、高感受性であるBalb/cとDBA/1には1.5 mg、低感受性であるC57BL/6には2.5 mgと5 mgの抗体カクテルを投与を行いました。上図は抗体カクテルの投与を0日目とし、3日目に50 µgのLPSをIP投与した結果です。スコアは1肢当たり0-4点、4肢で最高16点でのスコアで表しております（スコアリングについては関節炎スコアリング方法を参照ください）。

CAIA高感受性であるBalb/cとDBA/1では、IP投与とIV投与に大きな差は観察されませんでした。C57BL/6マウスにおいてはIP投与に比べてIV投与で高いスコアが得られており、C57BL/6マウスを用いる際はIV投与を推奨します。

LPS投与量について

関節炎惹起用抗体を用いたマウス関節炎モデルにおいて、マウスのLPSに対する感受性の変化により、LPS投与でマウスの激しい衰弱が起こり、稀に死に至るケースが報告されております。この問題を回避するためにマウス生産者の選択及びLPS用量の検討が必要な場合がございます。右図の通り、2用量において関節炎惹起能に大きな差はありませんが、LPS感受性が低下したマウスの場合を想定し、高用量の50 µg投与を推奨しております。しかし上記理由によりマウスのLPS感受性が高い場合、25 µg投与が適している場合もございます。マウスのLPS感受性が不明な場合は前試験としてLPSのみを単独投与（投与量25 µg/マウスと50 µg/マウスをそれぞれ2匹ずつ）により、マウスのLPS感受性（衰弱状態）を確認し、最適なLPS用量を設定することを推奨いたします。

関節炎スコアリング方法

Chondrexでは1肢当たり0-4点、4肢で最高16点のスコアリングを推奨しております。スコアをつける際には3つの関節を見ます（A：指、B：甲、C：手首）。こちらの方法では1本でも指関節の炎症が認められた場合にはスコアが1となります。
論文によっては指関節の炎症を起こした本数（指5本）をカウントしているものがありますが、手首、甲、指3本に腫れが認められるような重篤な状態と、指5本だけが腫れた状態とが同じスコアになってしまうことを避けるため、このようなスコアリング方法を採用しております。下記の写真と併せてご参照ください。

CONV環境における関節炎惹起能の低下

コンベンショナル（CONV）環境においてマウスのCAIAへの感受性低下について検討しました。

実験条件：
Balb/cマウス（7-8週齢、雄、5匹/グループ）

マウスは入手後にSPF環境及びCONV環境で3週間飼育し、Day 0に1.5 mgのカクテルをIP投与、Day 3にLPSを投与し、Day 0、3、5、7、10、14にマウスを観察しスコアリングを行いました。

SPFマウスは良好に関節炎を発症しますが（紫）、CONVマウスはSPFマウスに比べて、約60%程度の関節炎スコア（青）でした。この低い関節炎スコアはLPSの用量を変更しても（緑）、ロットを変更しても（赤）認められ、グループ間で差が認められません。CONVマウスでは全く発症しないという例もある為、抗体カクテルを用いたモデルマウス作製はSPF条件での実験を強く推奨いたします。