1. CHPを再構成後、-20℃または-80℃で分注して保管することは可能ですか。
ご希望により、-20℃または-80℃での保管も可能です。しかし、CHPは凍結融解サイクルの影響を受けないため、必ず小分けする必要はありません。
2. 再構成前の推奨保管温度が-20℃なのは何故ですか。
製品到着後、ご使用まで数ヶ月保管することもあると思います。初めてご使用いただく際の品質を保証するため、-20℃での保管を推奨しています。
3. CHPは、1つのペプチド分子に1つの標識分子が結合しているという理解で正しいですか。 この解釈が正しい場合、ペプチドの長さはコントロールしていますか。CHPが異なる長さのGXYペプチドの混合物である場合、1バイアル中のモル数の正確な計算は困難と考えられます。
ご指摘いただいた通りの理解で問題ありません。CHPプローブは組み換え法ではなく化学的に合成されるため、ペプチドの長さもコントロールしています。CHPは全ロット、同じ長さと分子量で提供され、HPLCとMALDI-MSで検証されています。
4. CHPプローブは、毎回使用する前に必ず加熱する必要がありますか。それとも、再構成時にのみ加熱する必要がありますか。未希釈のストック溶液に複数回の加熱-冷却処理を施しても、CHPは安定していますか。
CHPは一度冷却して4℃で保管すると、溶液中で三量体を形成する性質をもつため、一本鎖に解離させる必要があり、使用前の加熱は毎回必須です。CHPペプチドは化学的および物理的に非常に安定しており、加熱-冷却サイクルの回数に制限はありません。ただし、ストック溶液の加熱は推奨しません。推奨手順は、ストック溶液から必要量(例 10μL, 50μM)のみ分注し、PBSで必要な濃度(例 50μL, 10μM)に希釈することです。その後、ストック溶液は4℃の保管場所に戻し、希釈した溶液のみを加熱して実験に使用します。
5. 染色プロトコル(B)のステップ5において、分注に3分以上かかった場合、何か問題が発生しますか。
熱で解離したCHPは、再度三量体を形成するのに数時間かかるため、多少の遅れは問題ありません。ただし、加熱後数時間が経過したCHP溶液のご使用はおやめください。組織学的研究では、正常組織のコントロールスライドの使用及び、病理学的スライドと同じデッドタイムでの染色をお勧めします。これらは直接比較できます。一本鎖CHPは、加熱後の希釈溶液中で非常にゆっくりと再構築されるため、冷却と分注のデッドタイムを最小限に抑えることをお勧めします。
6. 4℃でインキュベートを行うのは何故ですか(例 染色プロトコル(B)のステップ6)。このステップを室温または37℃で実行した場合どうなりますか。
以下の理由から、4℃でのインキュベートを推奨します。
(1) 室温や37℃よりも、4℃の方が変性コラーゲンに対するCHPの親和性が強くなります。希望により室温または37℃でも行えますが、温度が低いほど結合レベルが高くなります。
(2) CHPは、凍結組織スライドの免疫染色に頻繁に使用されます。これらの固定されていない組織切片は、染色中は4℃に維持する必要があります。
7. プロトコル(B)のステップ6において、最低2時間、可能であれば一晩のインキュベーションを推奨と言及されています。2時間と一晩のインキュベーション時間の差で、どのように染色結果が異なりますか。
下記参考文献の、補足資料(図S2)に記載されています。
参考文献：In situ imaging of tissue remodeling with collagen hybridizing peptides. ACS Nano, 2017, 11, 9825–9835.
補足資料：https://pubs.acs.org/doi/suppl/10.1021/acsnano.7b03150/suppl_file/nn7b03150_si_001.pdf
8. どのような固定法が推奨ですか。固定法により、染色結果に影響を与えますか。
固定法により、試験結果に影響を与えることはありません。また、CHP染色に固定は必要ありませんが、他の理由で固定が必要な場合は、CHP染色の前に組織を固定できます。蛍光イメージング(F-CHP、R-CHP使用時など)では、パラホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドの代わりにホルムアルデヒドの使用を推奨します。ホルムアルデヒド固定組織は、特にFITC蛍光チャンネルにおいて、自家蛍光がはるかに少ないためです。パラホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドを使用しなければならない場合、B-CHPで組織を染色し、赤/近赤外色素(例 AlexaFluor 647)または酵素(例 HRP)で標識されたストレプトアビジンでの検出を推奨します。
9. 組織スライドをCHPと抗体で共染色するにはどうしたらいいですか。スライドが事前に免疫組織化学染色で染色されている場合、CHPによって再度染色することは可能ですか。
組織スライドをCHPと抗体で共染色するのは簡単です。加熱-冷却後のCHP溶液で、一次抗体を希釈してください。その後、抗体-CHP溶液でサンプルを4℃で一晩インキュベーションします。インキュベーション後、標識二次抗体で検出できます。共染色の手順は、プロトコルBおよびCで簡単に説明されています。例と詳細なプロトコルは、下記、2報の参考文献をご確認ください。3Helix社では、免疫組織化学染色で既に染色されたサンプルにCHPが機能するか確認していません。機能するか否かは、正確な免疫組織化学染色の内容、およびCHP結合を可視化するためにどのような検出方法が使用されるかに依存します。信頼できる結果を得るために、CHP染色では可能な限り、未染色のスライドの使用をお勧めします。
参考文献：In situ imaging of tissue remodeling with collagen hybridizing peptides. ACS Nano, 2017, 11, 9825–9835.
参考文献：Visualizing collagen proteolysis by peptide hybridization: From 3D cell culture to in vivo imaging. Biomaterials, 2018, 183, 67–76.
10. 免疫組織化学染色で抗原賦活化が必要な場合、CHP染色に影響を与えますか。
3Helix社内で、熱で抗原賦活化した組織サンプルをCHP染色した所、染色が大幅に増加したことを確認しています(未発表)。熱での抗原賦活化処理は組織内全てのコラーゲン分子を変性させるため、抗原賦活化後のCHP染色は、組織内の総コラーゲン量を明らかにするだけであると考えています。免疫組織化学染色で抗原賦活化が必要な場合、別の隣接するスライドを用いたCHP染色をお勧めします。
11. 増幅と感度を向上させるには、ビオチン標識CHP(B-CHP)を使用した方が良いですか。
多くの場合、F-CHP、R-CHP、B-CHP、いずれもよく機能します。より高い感度が必要とされる場合、赤色/近赤外領域の蛍光標識ストレプトアビジン(例 AlexaFluor647, 555)とB-CHPの組み合わせで最良の結果が得られます。これは、複数の蛍光分子がストレプトアビジン分子に結合するためです。HRPもシグナルを増強する一つの手法ですが、バックグラウンド染色が生じる可能性があります。
12. 組織学的実験では、ネガティブコントロールを使用した方が良いですか。また、検出したシグナルが変性コラーゲンに特異的に結合したものであるかの確認はどのように行えば良いですか。
加熱していないCHP溶液を使用することにより、結合が特異的なものか非特異的なものか確認できます。CHPは4℃の溶液中で三量体を形成する性質を持ち、加熱を行い一本鎖に分離させない限り、変性コラーゲンに結合する能力を持ちません。一方で、加熱後のCHPと同じ化学的性質を持つため、優れたネガティブコントロールとなります。ネガティブコントロールとしてのCHP溶液の作製方法は以下を参考にしてください。CHP原液を50μMより高い濃度(理想は100～150μM)で調製し、4℃で少なくとも2日間保管、その後、使用前に冷却されたPBSで直接希釈してください。
また、正常組織において何らかのバックグラウンド蛍光が検出されることは、ままあります。これは、CHPが正常組織中の低含量の変性コラーゲンに結合しているか(内因性コラーゲンリモデリングにより引き起こされるもの)、組織からの自家蛍光によるものが考えられます。
13. CHPは、細胞内の一本鎖または分解したコラーゲンに結合できますか。
はい、どちらにも結合可能です。細胞内染色のプロトコルの詳細については、Karl Kadler博士の文献(“Protection of circadian rhythms by the protein folding chaperone, BiP”)をご参照ください。